Tekočinska kromatografija je glavna metoda za testiranje vsebnosti vsake komponente in nečistoč v surovinah, intermediatih, pripravkih in embalažnih materialih, vendar številne snovi nimajo standardnih metod, na katere bi se lahko zanesle, zato je neizogiben razvoj novih metod. Pri razvoju metod tekoče faze je kromatografska kolona jedro tekočinske kromatografije, zato je ključnega pomena, kako izbrati primerno kromatografsko kolono. V tem članku bo avtor razložil, kako izbrati kolono za tekočinsko kromatografijo s treh vidikov: splošne ideje, premisleki in obseg uporabe.
A. Splošne ideje za izbiro kolon za tekočinsko kromatografijo
1. Ocenite fizikalne in kemijske lastnosti analita: kot so kemijska struktura, topnost, stabilnost (na primer, ali je enostavno oksidirati/reducirati/hidrolizirati), kislost in alkalnost itd., zlasti kemijska struktura je ključna dejavnik pri določanju lastnosti, kot je konjugirana skupina, ki ima močno ultravijolično absorpcijo in močno fluorescenco;
2. Določite namen analize: ali so potrebne visoka ločitev, visoka učinkovitost kolone, kratek čas analize, visoka občutljivost, odpornost na visok pritisk, dolga življenjska doba kolone, nizki stroški itd.;
- Izberite primerno kromatografsko kolono: razumejte sestavo, fizikalne in kemijske lastnosti kromatografskega polnila, kot so velikost delcev, velikost por, temperaturna toleranca, pH toleranca, adsorpcija analita itd.
- Premisleki pri izbiri kolon za tekočinsko kromatografijo
V tem poglavju bomo obravnavali dejavnike, ki jih je treba upoštevati pri izbiri kromatografske kolone z vidika fizikalnih in kemijskih lastnosti same kromatografske kolone. 2.1 Matrica polnila
2.1.1 Matrica iz silikagela Matrica polnila večine kolon za tekočinsko kromatografijo je silikagel. Ta vrsta polnila ima visoko čistost, nizko ceno, visoko mehansko trdnost in je enostavno spremeniti skupine (kot so fenilne vezi, amino vezi, ciano vezi itd.), vendar sta vrednost pH in temperaturno območje, ki jih prenaša, omejena: pH-razpon večine silikagelnih matričnih polnil je od 2 do 8, vendar je pH-razpon posebej modificiranih silikagelnih vezanih faz lahko celo od 1,5 do 10, obstajajo pa tudi posebej modificirane silikagelne vezane faze, ki so stabilne pri nizkem pH, kot je Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, ki je stabilen pri pH 1 do 8; zgornja temperaturna meja matrice silikagela je običajno 60 ℃, nekatere kromatografske kolone pa lahko prenesejo temperaturo 40 ℃ pri visokem pH.
2.1.2 Polimerna matrica Polimerna polnila so večinoma polistiren-divinilbenzen ali polimetakrilat. Njihove prednosti so, da prenesejo širok razpon pH – uporabljajo se lahko v območju od 1 do 14 in so bolj odporne na visoke temperature (lahko tudi nad 80 °C). V primerjavi s polnili C18 na osnovi silicijevega dioksida ima ta tip polnila večjo hidrofobnost, makroporozni polimer pa je zelo učinkovit pri ločevanju vzorcev, kot so beljakovine. Njegove slabosti so, da je učinkovitost kolone nižja in mehanska trdnost nižja kot pri polnilih na osnovi silicijevega dioksida. 2.2 Oblika delcev
Večina sodobnih HPLC polnil je sferičnih delcev, včasih pa so tudi nepravilni delci. Sferični delci lahko zagotovijo nižji tlak kolone, večjo učinkovitost kolone, stabilnost in daljšo življenjsko dobo; pri uporabi visokoviskoznih mobilnih faz (kot je fosforna kislina) ali ko je raztopina vzorca viskozna, imajo nepravilni delci večjo specifično površino, kar je bolj ugodno za polno delovanje obeh faz, cena pa je relativno nizka. 2.3 Velikost delcev
Manjša kot je velikost delcev, večja je učinkovitost kolone in večja je ločitev, vendar je slabša odpornost na visok pritisk. Najpogosteje uporabljena kolona je kolona z velikostjo delcev 5 μm; če je zahteva po ločevanju visoka, je mogoče izbrati 1,5-3 μm polnilo, kar je ugodno za rešitev problema ločevanja nekaterih kompleksnih matričnih in večkomponentnih vzorcev. UPLC lahko uporablja 1,5 μm polnila; Za semipreparativne ali preparativne kolone se pogosto uporabljajo polnila z velikostjo delcev 10 μm ali več. 2.4 Vsebnost ogljika
Vsebnost ogljika se nanaša na delež vezane faze na površini silikagela, ki je povezan s specifično površino in pokritostjo vezane faze. Visoka vsebnost ogljika zagotavlja visoko zmogljivost kolone in visoko ločljivost ter se pogosto uporablja za kompleksne vzorce, ki zahtevajo visoko ločitev, vendar je zaradi dolgega časa interakcije med obema fazama čas analize dolg; kromatografske kolone z nizko vsebnostjo ogljika imajo krajši čas analize in lahko pokažejo različne selektivnosti ter se pogosto uporabljajo za preproste vzorce, ki zahtevajo hitro analizo, in vzorce, ki zahtevajo visoke pogoje vodne faze. Na splošno se vsebnost ogljika v C18 giblje od 7 % do 19 %. 2.5 Velikost por in specifična površina
HPLC adsorpcijski mediji so porozni delci in večina interakcij poteka v porah. Zato morajo molekule vstopiti v pore, da se adsorbirajo in ločijo.
Velikost por in specifična površina sta dva komplementarna pojma. Majhna velikost por pomeni veliko specifično površino in obratno. Velika specifična površina lahko poveča interakcijo med vzorčnimi molekulami in vezanimi fazami, poveča zadrževanje, poveča obremenitev vzorca in kapaciteto kolone ter ločevanje kompleksnih komponent. Med te vrste polnil spadajo polno porozna polnila. Za tiste z visokimi zahtevami po ločevanju je priporočljivo izbrati polnila z veliko specifično površino; majhna specifična površina lahko zmanjša protitlak, izboljša učinkovitost kolone in skrajša ravnotežni čas, kar je primerno za analizo gradienta. Med te vrste polnil spadajo polnila jedro-lupina. Zaradi zagotavljanja ločevanja je priporočljivo izbrati polnila z majhno specifično površino za tiste z visokimi zahtevami glede učinkovitosti analize. 2.6 Volumen por in mehanska trdnost
Volumen por, znan tudi kot "volumen por", se nanaša na velikost praznine na enoto delca. Lahko dobro odraža mehansko trdnost polnila. Mehanska trdnost polnil z velikim volumnom por je nekoliko šibkejša kot pri polnilih z majhnim volumnom por. Polnila z volumnom por, manjšim ali enakim 1,5 ml/g, se večinoma uporabljajo za ločevanje s HPLC, medtem ko se polnila z volumnom por, večjim od 1,5 ml/g, večinoma uporabljajo za molekularno izključitveno kromatografijo in nizkotlačno kromatografijo. 2.7 Stopnja omejitve
Zapiranje lahko zmanjša vrhove repov, ki jih povzroči interakcija med spojinami in izpostavljenimi silanolnimi skupinami (kot so ionske vezi med alkalnimi spojinami in silanolnimi skupinami, van der Waalsove sile in vodikove vezi med kislimi spojinami in silanolnimi skupinami), s čimer se izboljša učinkovitost kolone in oblika vrha . Neomejene vezane faze bodo ustvarile različne selektivnosti glede na zaprte vezane faze, zlasti za polarne vzorce.
- Področje uporabe različnih kolon za tekočinsko kromatografijo
V tem poglavju bo opisano področje uporabe različnih vrst kolon za tekočinsko kromatografijo v nekaterih primerih.
3.1 Kromatografska kolona C18 z reverzno fazo
Kolona C18 je najpogosteje uporabljena kolona z reverzno fazo, ki lahko ustreza testom vsebnosti in nečistoč večine organskih snovi in je uporabna za srednje polarne, šibko polarne in nepolarne snovi. Tip in specifikacijo kromatografske kolone C18 je treba izbrati glede na posebne zahteve za ločevanje. Na primer, za snovi z visokimi zahtevami po ločevanju se pogosto uporabljajo specifikacije 5 μm*4,6 mm*250 mm; za snovi s kompleksnimi ločevalnimi matricami in podobno polarnostjo se lahko uporabijo specifikacije 4 μm*4,6 mm*250 mm ali manjše velikosti delcev. Avtor je na primer uporabil kolono 3 μm*4,6 mm*250 mm za odkrivanje dveh genotoksičnih nečistoč v API celekoksiba. Ločitev obeh snovi lahko doseže 2,9, kar je odlično. Poleg tega se pod predpostavko zagotavljanja ločevanja, če je potrebna hitra analiza, pogosto izbere kratka kolona 10 mm ali 15 mm. Na primer, ko je avtor uporabil LC-MS/MS za odkrivanje genotoksične nečistoče v API piperakin fosfatu, je bila uporabljena kolona 3 μm * 2,1 mm * 100 mm. Ločitev med nečistoto in glavno komponento je bila 2,0, odkrivanje vzorca pa je mogoče zaključiti v 5 minutah. 3.2 Fenilna kolona z reverzno fazo
Fenilna kolona je tudi vrsta kolone z reverzno fazo. Ta vrsta kolone ima močno selektivnost za aromatske spojine. Če je odziv aromatskih spojin, izmerjen z navadno kolono C18, šibek, lahko razmislite o zamenjavi fenilne kolone. Na primer, ko sem izdeloval API za celekoksib, je bil odziv glavne komponente, izmerjen s fenilno kolono istega proizvajalca in iste specifikacije (vse 5 μm*4,6 mm*250 mm), približno 7-krat večji od odziva kolone C18. 3.3 Kolona normalne faze
Kot učinkovito dopolnilo koloni z reverzno fazo je kolona normalne faze primerna za visoko polarne spojine. Če je vrh še vedno zelo hiter pri eluiranju z več kot 90 % vodne faze v koloni z reverzno fazo in celo blizu vrha topila in se z njim prekriva, lahko razmislite o zamenjavi kolone z normalno fazo. Ta vrsta kolone vključuje hilično kolono, amino kolono, ciano kolono itd.
3.3.1 Hilična kolona Hilična kolona običajno vgradi hidrofilne skupine v vezano alkilno verigo za izboljšanje odziva na polarne snovi. Ta tip kolone je primeren za analizo sladkornih snovi. Avtor je to vrsto stolpca uporabil, ko je delal vsebino in sorodne snovi ksiloze in njenih derivatov. Izomere derivata ksiloze lahko tudi dobro ločimo;
3.3.2 Amino kolona in ciano kolona Amino kolona in ciano kolona se nanašata na uvedbo amino oziroma ciano modifikacij na koncu vezane alkilne verige, da se izboljša selektivnost za posebne snovi: na primer, amino kolona je dobra izbira za ločevanje sladkorjev, aminokislin, baz in amidov; ciano kolona ima boljšo selektivnost pri ločevanju hidrogeniranih in nehidrogeniranih strukturno podobnih snovi zaradi prisotnosti konjugiranih vezi. Amino kolono in ciano kolono je mogoče pogosto preklapljati med kolono normalne faze in kolono reverzne faze, vendar pogosto preklapljanje ni priporočljivo. 3.4 Kiralni stolpec
Kiralna kolona, kot že ime pove, je primerna za ločevanje in analizo kiralnih spojin, predvsem na področju farmacije. To vrsto kolone lahko upoštevamo, kadar konvencionalne kolone z reverzno fazo in normalne faze ne morejo doseči ločevanja izomerov. Na primer, avtor je uporabil kiralno kolono 5 μm*4,6 mm*250 mm za ločevanje dveh izomerov 1,2-difeniletilendiamina: (1S, 2S)-1,2-difeniletilendiamina in (1R, 2R)-1,2 -difeniletilendiamin, in ločitev med obema je dosegla približno 2,0. Vendar so kiralni stolpci dražji od drugih vrst stolpcev, običajno 1W+/kos. Če obstaja potreba po takih stolpcih, mora enota zagotoviti zadosten proračun. 3.5 Ionska izmenjevalna kolona
Kolone za ionsko izmenjavo so primerne za ločevanje in analizo nabitih ionov, kot so ioni, proteini, nukleinske kisline in nekatere sladkorne snovi. Glede na vrsto polnila jih delimo na kolone za kationsko izmenjavo, kolone za anionsko izmenjavo in kolone za močno kationsko izmenjavo.
Kationske izmenjevalne kolone vključujejo kolone na osnovi kalcija in vodika, ki so primerne predvsem za analizo kationskih snovi, kot so aminokisline. Avtor je na primer uporabil kolone na osnovi kalcija pri analizi kalcijevega glukonata in kalcijevega acetata v raztopini za izpiranje. Obe snovi sta imeli močne odzive pri λ=210 n, stopnja ločitve pa je dosegla 3,0; avtor je pri analizi snovi, povezanih z glukozo, uporabil kolone na osnovi vodika. Več glavnih sorodnih snovi – maltoza, maltotrioza in fruktoza – je imelo visoko občutljivost pod diferencialnimi detektorji, z mejo zaznavanja le 0,5 ppm in stopnjo ločevanja 2,0–2,5.
Anionske izmenjevalne kolone so primerne predvsem za analizo anionskih snovi, kot so organske kisline in halogenski ioni; močne kationske izmenjevalne kolone imajo višjo kapaciteto ionske izmenjave in selektivnost ter so primerne za ločevanje in analizo kompleksnih vzorcev.
Zgoraj je le uvod v vrste in področja uporabe več običajnih kolon za tekočinsko kromatografijo v kombinaciji z avtorjevimi izkušnjami. Obstajajo tudi druge posebne vrste kromatografskih kolon v dejanskih aplikacijah, kot so kromatografske kolone z velikimi porami, kromatografske kolone z majhnimi porami, kolone za afinitetno kromatografijo, večmodne kromatografske kolone, kolone za tekočinsko kromatografijo ultra visoke ločljivosti (UHPLC), kolone za superkritično tekočinsko kromatografijo ( SFC) itd. Imajo pomembno vlogo na različnih področjih. Posebno vrsto kromatografske kolone je treba izbrati glede na strukturo in lastnosti vzorca, zahteve za ločevanje in druge namene.
Čas objave: 14. junij 2024